MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANOS Y TINCIÓN DE GRAM
Introducción
Aunque las bacterias están ampliamente distribuidas en la naturaleza, para conocer su fisiología es necesario estudiarlas en el laboratorio en cultivos controlados y puros. Los medios de cultivo bacterianos son disoluciones acuosas con nutrientes orgánicos (monosacáridos, ácidos grasos, etc.) e inorgánicos (sales minerales) que satisfacen los principales elementos químicos que necesitan las bacterias para su metabolismo. Algunas bacterias también necesitan la presencia de ciertos oligoelementos en su medio de cultivo para poder reproducirse.
Los medios de cultivo de las bacterias se preparan en medio líquido en tubos de ensayo a los que se les añaden las muestras de bacterias que se quieren cultivar; frecuentemente se utilizan cultivos en estado de gel (semisólido) que se obtienen al añadir al medio líquido una sustancia gelificante como el agar. Los medios de cultivo semisólidos se preparan en placas de Petri.
La tinción de Gram: con este método, las bacterias aparecen teñidas de azul o rojo, debido a la diferente estructura de la pared bacteriana. Todas las bacterias permiten el paso del cristal violeta que las tiñe de azul. Ante el tratamiento con lugol, las gram positivas forman un esmalte impermeable al alcohol, por lo que no se decoloran, así mantienen el color azul después del tratamiento consafranina. Pero las gram negativas no tienen componentes químicos en la pared, por lo que con etanol se decoloran y la safranina las tiñe de rojo.
Tarea
1.Preparación de un medio de cultivo. Tras dos días, observar lo que ocurre y responder a las siguientes cuestiones:
- ¿Qué ha aparecido en el medio de cultivo?
- ¿Cómo lo interpretas?
2.Llevar a cabo una tinción de Gram, que permite la observación de las bacterias a microscopio óptico y también, según su respuesta a los colorantes, clasificarlas en dos grupos, las gram positivas y las gram negativas.
Materiales necesarios: colorantes (cristal violeta, lugol y safranina), agua destilada, etanol, papel de filtro, portaobjetos y microscopio óptico.
Responder a las cuestiones:
- ¿Qué forma tienen las bacterias que has preparado?
- ¿Forman colonias o agrupaciones?
- ¿De qué color las ves?
- ¿Son las bacterias que has teñido gram positivas o gram negativas?
- Explica por qué se tiñen.
Proceso
Todo el procedimiento se realizará por parejas, salvo las cuestiones que se harán de forma individual.1.Para la realización del medio de cultivo, se añaden los siguientes ingredientes: 1000 ml. de agua destilada, 10 g de glucosa, 8 g de fosfato potásico, 1 g de sulfato amónico, 0´2 g de sulfato magnésico, 0´05 g de cloruro cálcico y una pequeña cantidad de agar en una placa de Petri. Tocar la suerficie con un asa de siembra que haya estado en contacto con agua contaminada.
2. a) Colocar y extender sobre un portaobjetos una muestra de sarro dental de yogur o una gota de agua contaminada.
b) Dejar secar y fijar la muestra con calor (sobre el mechero de alcohol pero sin tocar la llama).
c) Teñir con el colorante cristal violeta durante 3 minutos.
d) Lavar con agua destilada.
e) Teñir con lugol 2 minutos.f) Lavar con etanol y luego con agua destilada.
g) Teñir con safranina un minuto y lavar con agua.
h) Secar con papel de filtro sin frotar.
i) Observar al microscopio.
Recursos
Se puede obtener mas informacion complementaria en:
http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/medicult.pdf
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
http://www.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas
http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EElpZEVkykPMncqxmd.php
http://www.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/15.pdf
http://es.geocities.com/joakinicu/apartado3e.htm
http://danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/tincion/tincion_gramneg.html
Evaluación
Los alumnos deberán llevar a cabo las dos tareas correctamente y responder a las cuestiones correspondientes. El metodo de evaluación será:
- La realización de las tareas ponderará un 60% de la nota final, un 30% de cada uno de las tareas. Se obtendrá la maxima puntuación si en los resultados finales de las tareas se observan:
- Bacterias sobre la superficie de agar.
- Bacterias gram positivas o gram negativas observables al microscopio.
Se tendra en cuenta el trabajo en parejas, el orden en los pasos a seguir, la iniciativa de cada alumno y el cuidado en el manejo de los materiales.
- El 40% de la nota final se obtendrá con la correcta respuesta de las preguntas realizadas. Se tendrá en cuenta la capacidad de síntesis, de asimilación y expresión individual.
Conclusión
Con este trabajo se pretende fijar la teoria mediante practicas, fomentar el trabajo por parejas y el seguimiento correcto de un protocolo.
El tema elegido se debe a que los alumnos puedan observar las bacterias que puede haber en cualquier lugar como por ejemplo un yogur, que aprendan a diferenc iarlas obsevandolas al microscopio y conozcan los requerimientos nutricionales para su crecimiento en medios elaborados por ellos mismos.
